细胞融合实验报告

时间：2021-09-24　来源：博通范文网本文已影响人

【实验题目】

动物细胞融合

【实验目的】

1.了解动物细胞融合的常用方法。

2.学习化学融合的基本操作过程。

3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。

【实验材料与用品】

1、材料

鸡血红细胞

2、试剂

50%PEG、GKN 溶液、Alsever’s 细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。

3、器材

倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。

【实验原理】

细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。

1、病毒诱导融合

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

2、化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、

甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。

3、电激诱导融合

包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验步骤】

在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用 PEG 使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下：

1、取鸡血 2ml+2mlAlsever 液，再加入 6mlAlsever 液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】

2、取（1）中悬液 1ml+4ml 的 0.85%的 NaCl 溶液，进行以下三次离心处理：

1200r/min 下离心 5min，去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl 溶液至 5ml；

1000-1200r/min 下离心 5min，去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl 溶液至 5ml；

1000-1200r/min 下离心 7min

【因时间关系此次实验只离心一次】

3、将离心后的沉降血球（去上清后约 0.1-0.2ml）加入 GKN 至 1-2ml，使之成为 10%的细胞悬液；

4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个；

5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，

2-3min 后，显微镜下观察。

【实验结果】

1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞：

呈现哑铃状；

④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。

比较典型的细胞融合时的形态如下图：

图 1

图 2

图 3

初

步

接

触

融

合

图 4

图 5

图 6

图 7

图 8

2、在三种不同浓度的细胞悬液中，所观察到的细胞发生质膜融合的比率不同，如下图所示：

细胞进一步融合融合完成

图 1：

1 号溶液中细胞融合整体图像

图 2：

2 号溶液中细胞融合整体图像

图 3：

3 号溶液细胞融合整体图像

【讨论与结论】

1、实验结果经过 PEG 的介导融合，鸡血红细胞中有少部分细胞发生了融合，且多处于融合刚开始的阶段。大部分细胞仍处于离散状态，另外，视野中还发现有细胞聚集成团的现象。

另外，本次实验进行了细胞悬液三个不同浓度的融合实验，1ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+1.0ml50%PEG，前两组的细胞融合率明显没有第三组的细胞融合率高，因此可以得出结论：在一定范围内，PEG的浓度越高，细胞融合率越高。另外，由于本次实验中的细胞悬液浓度偏低，因此无法直观的对前两组进行融合率的比较，但从理论上分析，在 PEG 浓度一定时应该是细胞浓度高的融合率高（细胞间的接触几率增大）。

2、结果分析积较大，易于实验观察。

心，目的是充分清洗细胞表面，使细胞接触面积达到最大，有利于细胞间的融合。每次离心前都要将样品小心混匀，否则有可能出现聚集成团的细胞。

过高。

④视野中经常会看到两个或多个细胞接触在一起，此时不一定就是融合的细胞，需要转动细准焦螺旋对接触部分进行观察，通过观察接触部位细胞膜的有无判断其为融合细胞还是重叠在一起的细胞。

⑤本次实验采用的是 PEG 介导，融合效果受到以下几个因素的影响：PEG 分子的分子量和浓度、PEG 作用时间、融合温度、PH 值。在一定范围内适当调节这些条件，可以将融合率提高。但在进行科研时还应考虑到，PEG 分子对细胞存活的影响（PEG 具有一定的毒性，且分子量越大毒性越大），因此取分子量 800-1000较适合。

⑥1 号试管中的细胞悬液出现类似血丝的悬浊物，可能是加入 PEG 之后没有及时混合均匀，细胞大量聚集。因此在加入 PEG 后先反应 30s 左右后小心混匀，否

则会导致细胞融合不充分。且在加入时尽量避免震动。

附：细胞融合的应用

动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，可用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品。在培育动物新品种时，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科。

动物细胞融合技术对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。

1、生产单克隆抗体

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的 B 淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有 B 淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。

2、

用于基因定位和绘制人类基因图谱

杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。

3、

动物育种

体细胞核移植技术是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体。但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术做了良好的铺垫。

4、细胞疗法

将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，而且也避免宿主对外来物的免疫排斥。

5、植物细胞融合

植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，在生产研究应用方面，通过诱导不同种属间甚至不同科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂交植株。

植物细胞融合可以将细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀动物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等等。

6、

微生物细胞融合技术

对微生物而言，该技术主要用于改良微生物菌种特性，提高目的产物的产量，使菌种获得新的性状，合成新产物等。

微生物细胞融合技术的一项突出应用是生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等。它适用于疾病的诊断、预防及治疗等。另一方面的突出应用就是为发酵工业提供优良菌种。

原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟

实验一培养基母液的配制

一、实验目的

通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法二、实验原理

配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂

NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2·2H2O ,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O Na2-EDTA,MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,,KI,CuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备

电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。

四、实验步骤 1 大量元素母液的配制

先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , MgSO4·7H2O, CaCl2·2H2O，待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制

按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO4·4H2O, ZnSO4·7H2O H3BO3, KI, Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O,按制备母液I的方法逐个溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备把FeSO4·7H2O和Na2-EDTA分别置于适量蒸馏水中，加热搅拌使之完全溶解，保持加热，把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并搅拌，接近沸腾时停止加热，冷却后调PH到5.5，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，转入细口试剂瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 4有机化合物母液的制备

按配方表中用量依次称取：维生素B, 烟酸, 甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容后，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 5植物生长物质母液制备

NAA母液:准确称取20mg,先少量95%乙醇引溶后加水定容至100ml,即配制成0.2mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 6–BA母液配制方法相似，浓度为2mg/ml。

五、试验结果分析及注意事项配制母液时注意药品只能出不能进。

实验二培养基的配制与灭菌一、实验目的

学习母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法二、实验原理

组织培养所用的培养基含有植物生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必须对培养基灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三、实验材料、试剂和仪器设备

1.试剂：琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/L NaOH,各类母液

2.仪器设备：电子天平，烧杯，量筒，移液管，玻璃棒，药芍，称量纸，PH试纸，锥形瓶瓶等。

四、实验步骤

1.将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿放在指定位置 2 .取50ml烧杯一个，将大量、有机、肌醇、镁盐，钙盐、按配方表中的用量依次称取并倒入烧杯中。

3 .取 50ml烧杯一个，将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入烧杯中。 4.取瓷盆一个，加入300ml蒸馏水，置于电磁炉上加热，称量琼脂6克，白砂糖 40 克，依次倒入瓷盆中，待琼脂和白砂糖完全溶解后，将称量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不断搅拌，并定容至 1 L。 5 .用1mol/L NaOH调PH 至 5.8 6.把培养基分装到广口瓶中，用牛皮纸包扎好，待灭菌。 7.培养基灭菌

五、试验结果分析及注意事项

配制培养基前先大致估计一下药品数量，不够时提前配制。培养基灭菌时注意要放干净冷空气。

实验三愈伤组织的诱导

一、实验目的

通过实验，初步掌握外植体材料消毒及在超净工作台上接种的方法与注意事项二、实验原理

植物细胞具有全能型，其外植体接种在无菌的人工培养基上，能长成完整的无菌植株。

三、实验材料、试剂和仪器设备

超净工作台、培养基，大号镊子，剪刀，酒精灯，喷雾器

四、实验步骤

1.准备打开超净工作台，用紫外灯烧2h,关闭紫外灯，将灭菌溶液，无菌水，豌豆，大烧杯等放入超净工作台，在台上点燃2个酒精灯。

2.灭菌在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用84消毒液摇晃清洗清洗3次，每次5分钟，后用0.5%HgCI摇晃清洗，处理2次，每次5分钟。后用无菌水摇晃清洗3次。

3.接种将灭菌处理好的材料在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装5粒豌豆，接种过程中锥形瓶应一直保持倾斜，直到接种完毕盖上棉塞。